การใช้เทคนิค UV –VIS Spectroscopy  (H-33)
จากคุณ : นางสาวพรลดา ศรีประพัติ(ศูนย์วิจัยและพัฒนาสิ่งแวกดล้อมโรงงานภาคตะวันออก) - [25/8/2552 11:30:43]

การาดูดกลืนแสงหรือรังสีที่อยู่ในช่วงอัลตราไวโอเลตและวิซิเบิล ซึ่งอยู่ในช่วงความยาวคลื่นประมาณ 190-800 นาโนเมตร (nm) ของสารเคมีนั้น ส่วนใหญ่ได้แก่สารอินทรีย์ (Organic compound) หรือสารประกอบเชิงซ้อน (Complex compound ) หรือสารอนินทรีย์ (inorganic compound) ทั้งที่มีสีและไม่มีสี สมบัติของสารดังกล่าวนี้ได้นำมาใช้วิเคราะห์ทั้งในเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณอย่างกว้างขวาง เพราะวิธีนี้ให้ความเที่ยงและความแม่นดี และมีสภาพไว (Sensitivity) สูง โดยอาจทำการวิเคราะห์อยู่ในรูปของธาตุหรือโมเลกุลก็ได้ แต่ในกรณีที่จะนำไปพิสูจน์ว่าสารตัวนั้นเป็นสารอะไร มีโครงสร้างอย่างไร อาจจะต้องใช้เทคนิคอย่างอื่นเข้าช่วยด้วย เพื่อให้เกิดความแน่ใจ เช่น ใช้เทคนิคทาง IR หรือ NMR spectroscopy
โดยทั้งไป เทคนิคการวิเคราะห์นี้บางครั้งนิยมเรียกว่า ยูวี –วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตเมตรีถ้าสารที่ทำการวิเคราะห์มีสีหรือทำให้เกิดสีขึ้น สารที่มีสีนั้นจะดูดกลืนแสงในช่วงวิสิเบิล อาจเรียกว่า คัลเลอริเมตรี(Colorimetry)
เมื่อให้ลำแสงที่เคลื่อนที่อย่างต่อเนื่องกัน (continuous beam of radiation) ผ่านเข้าไปในวัตถุใสจะพบว่าแสงบางส่วนถูกดูดกลืน บางส่วนเกิดการสะท้อน บางส่วนกระเจิง และบางส่วนทะลุออกไป ดังรูปที่ 1 ถ้าให้แสงทะลุออกไปนั้นผ่านเข้าเครื่องกระจายแสง (เช่นปริซึมหรือ เกรตติง) จะเห็นว่าสเปกตรัมหายไปส่วนหนึ่ง ส่วนที่หายไปนี้เรียกว่า Absorption spectrum พลังที่ดูดกลืนไปนั้นจะทำให้โมเลกุลหรืออะตอมเปลี่ยนระดับพลังงานจากสถานะพื้น (ground state) ไปยังสถานะกระตุ้น (excited state) ดังรูปที่2

รูปที่ 2 แสดงกระบวนการเกิดการกระตุ้น

1. สาเหตุของการดูดกลืนแสงในช่วงยูวี – วิสิเบิล (UV-VIS Absorption)
เมื่อแสงที่อยู่ในช่วง ยูวี –วิสิเบิล ผ่านเข้าไปในโมเลกุลของสาร สารนั้นจะถูกดูดกลืนแสงเฉพาะบางช่วงทำให้เกิดมีการเปลี่ยนแปลงระดับพลังงานประมาณ 30-150 kcal/mole และอิเล็กตรอนที่เกี่ยวข้อง คืออิเล็กตรอนที่อยู่วงนอกสุดหรืออิเล็กตรอนที่เกิดพันธะแล้ว หรืออิเล็กตรอนที่ยังไม่เกิดพันธะ (non-bonding electrons) ซึ่งแต่ละชนิดจะมีพลังแตกต่างกัน อิเล็กตรอนที่ได้รับพลังงานสูงขึ้นนี้เรียกว่า antibonding orbitals


2. หลักในการหาปริมาณของสารกับการวัดปริมาณของแสงที่ถูกดูดกลืน
ในการวัดปริมาณของแสงหรือ radiation ที่ถูกดูดกลืนด้วยสารตัวอย่างนั้น เราสามารถทำได้โดยให้ลำแสงผ่านเข้าไปในสารตัวอย่าง แล้ววัดปริมาณของแสงที่ผ่านทะลุออกมาโดยเปรียบเทียบกับแสงที่ทะลุออกมาเมื่อไม่มีสารตัวอย่าง
เมื่อพิจารณาถึงเรื่องการเปลี่ยนแปลงของ radiant power ที่เกิดจากการผ่าน monochromatic radiation เข้าไปยังเซลล์ ซึ่งใส่แต่ตัวทำละลายกับสารอื่น ๆ ซึ่งไม่มีสารที่จะดูดกลืนแสง เรียกว่า Blank solution ดังนั้น radiant power ที่ผ่านทะลุออกมาให้เป็น Po



3. คำ ความหมาย และสัญลักษณ์ที่ใช้ในเรื่องของการดูดกลืนแสง
มีคำและความหมาย ตลอดจนสัญลักษณ์ที่ได้รับการรับรองให้ใช้จากทางเคมีวิเคราะห์และ ASTM เพื่อให้เกิดความเข้าใจที่ตรงกัน และลดความหลากหลายในการเขียน ทั้งนี้จะได้เปรียบเทียบกัน คำเก่าที่ใช้ด้วยดังนี้

ตารางที่ 1 คำ ความหมาย และสัญลักษณ์ที่ใช้ในเรื่องของการดูดกลืนแสง
ชื่อ สัญลักษณ์ คำจำกัดความ ชื่ออย่างอื่นที่ใช้
Radiant Power P,Po เป็นพลังงานของเสงหรือรังสีที่ตกในมาตรวัดต่อ ซม2 ต่อวินาที ความเข้มของแสงหรือรังสี I, Io
แอบซอร์แบนซ์ A
Optical density ,OD ,extinction ,E
ทรานสมิตแทนซ์
(Transmittance) T
ทรานสมิสชัน, T (traasmission)
ความกว้างของเซลล์ b ระยะทางที่แสงผ่านเป็น ซม. l (length)
d (distance)
โมลาร์แอบซอร์พดิวิตี้
(molar absorptivity) 
(C = โมล/ลิตร) Molar extinction coeffcient
แอบซอร์พติวิตี้
(absorptivity) a
(C = กรัม/ลิตร) extinction coefficient ,k
ความยาวคลื่น 
(nm,10 -9 m) m (millimicron)


4. ข้อจำกัดในการใช้กฎของเบียร์ (Limitations or Deviations of Beer ‘s Law)
ข้อกำจัดที่ทำให้กฎของเบียร์ต้องเบี่ยงเบนหรือใช้ไม่ได้ นั่นคือค่า แอบซอร์แบนที่วัดได้ไม่เป็นปฎิภาคโดยตรงกับความเข้มข้น เมื่อให้ความกว้างของเซลล์คงที่หรือเมื่อนำค่าแอบซอร์แบนซ์ที่วัดจากความเข้มข้นต่าง ๆกันเขียนกราฟระหว่างค่าแอบซอร์แบนซ์กับความเข้มข้นแล้วได้กราฟไม่เป็นเส้นตรง (อาจจะโค้งขึ้นหรือโค้งลง ดังรูปที่ 4 )


สาเหตุที่สำคัญอาจจำแนกได้เป็น 2 พวกใหญ่ ๆ คือ
1. เนื่องจากความเบี่ยงเบนทางเคมี (Chemical deviations) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของสารที่ปนกันอยู่ในสารละลายนั้น
2. เนื่องจากความเบี่ยงเบนของเครื่องมือ (instrumental deviations) ซึ่งเกี่ยวกับเครื่องมือโดยเฉพาะ

5. ขั้นตอนต่าง ๆ ของการวิเคราะห์โดยใช้ UV-VIS spectrophotometer Techniques
ก่อนที่จะทำการวิเคราะห์สารตัวอย่างทั้งทางคุณภาพและปริมาณวิเคราะห์ ควรจะได้ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่าง ๆ เสียก่อนที่สำคัญคือ
5.1 ศึกษาการเตรียมสารละลายตัวอย่าง โดยเลือกตัวทำละลายให้เหมาะสม นั่นคือตัวทำละลายจะต้องไม่มีการดูดกลืนแสงในช่วงเดียวกับสารตัวอย่าง โมเลกุลไม่ควรมี conjugated system ในตารางที่ 2 เป็นตัวอย่างของตัวทำละลายที่ใช้เสมอ ๆ ใน UV-VIS spectroscopy และค่าความยาวคลื่นที่ต่ำที่สุดที่ใช้ได้ (Cut –off point)
ตารางที่ 2 แสดงตัวทำละลายที่ใช้ได้ในช่วง UV –visible
ตัวทำละลาย Cut-off Point
(nm) ตัวทำละลาย Cut-off Point
(nm)
Water 190 Isopropyl alcohol 210
Acetronitrile 190 Isooctane 220
Cyclohexane 210 Methanol 210
Chrofrom 250 Diethy ether 210
Carbontetrachloride 260 Ethanol 210
1,4 Dioxane 220 n-Hexane 220


5.2 เลือกใช้สภาวะของเครื่องมือให้ถูกต้อง นั่นคือ หลอดกำเนิดแสง (light sources) ที่จะใช้อาจเป็น
Tungsten lamp หรือ UV-lamp หรือ Deuterium lamp ตลอดจนการเลือกใช้สลิทให้ถูกต้องด้วย
5.3 ศึกษาแอบซอร์พชันสเปกตรัมโดยสแกน (scan) ค่าแอบซอร์พแบนซ์กับความยาวคลื่นจาก
สเปกตรัม จะทำให้เราทราบว่าควรเลือก max ที่ความยาวคลื่นเท่าใด

6. ศึกษาตัวแปรต่าง ๆ ที่จะทำให้ค่าแอบซอร์แบนซ์เปลี่ยนแปลงได้
1. ตัวทำละลาย
2. pH ของสารละลายซึ่งเป็นสิ่งสำคัญมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิเคราะห์สารอนินทรีย์ซึ่งอยู่ในช่วงวิซิเบิล หรือใช้วิธีทำให้เกิดสารประกอบเชิงซ้อนที่มีสี จำเป็นต้องควบคุม pH โดยใช้บัพเฟอร์หรืออาจใช้วิธีวัดที่ Isobestic point หรือ Isoabsorptive point ซึ่งเป็นยาวคลื่นที่ค่าแอบซอร์แบนซ์คงที่เมื่อสารละลายมี pH ต่าง ๆ กัน
3. ตัวรบกวน (interferences) มีหรือไม่ ถ้ามีต้องหาวิธีการแก้ไขหรือทางกำจัดให้หมดไปเสียก่อนจึงวัดค่าแอบซอร์แบนซ์ ได้มิฉะนั้นจะได้ผลไม่ถูกต้อง
4. ในกรณีที่ใช้วิธีทำให้เกิดสารประกอบเชิงซ้อน ควรจะศึกษาความเสถียรของสารประกอบเชิงซ้อนเสียก่อน ตลอดจนเวลาที่ใช้ในการทำให้เกิดปฏิกิริยาสมบูรณ์ผลการเติมสารละลายที่มากเกินพอ เป็นต้น

7. การวิเคราะห์หาปริมาณของสารด้วยการใช้เทคนิคทางยูวี-วิสิเบิลสเปกโทรสโกปี
วิธีวิเคราะห์ที่นิยมใช้กันโดยทั่วไปมีดังนี้
ในกรณีสารตัวอย่างมีสารที่จะวิเคราะห์เพียงสารเดียว อาจใช้วิธีทำกราฟมาตรฐานโดยเตรียมสารละลายมาตรฐานที่ความเข้มข้นต่าง ๆ กัน แล้วนำไปวัดค่าแอบซอร์พแบนซ์ที่ max โดยเทียบกับ Blank นำผลที่ได้มาเขียนกราฟระหว่างค่าแอบซอร์แบนซ์กับความเข้มข้น จะได้กราฟเป็นเส้นตรง เมื่อวัดค่าแอบซอร์แบนซ์ของสารตัวอย่างได้ ก็จะหาปริมาณของสารที่จะวิเคราะห์ได้โดยอ่านจากกราฟมาตรฐานและลักษณ์ของสเปกตรัม ในปัจจุบันนี้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์มักจะมีไมโครโปรเซสเซอร์หรือไมโครคอมพิวเตอร์ประกอบอยู่ด้วยใช้ทั้งในการควบคุม เก็บข้อมูล คำนวณผล และรายงานผล ทำให้สะดวกต่อนักวิเคราะห์ขึ้นอย่างมาก












8. ส่วนประกอบของเครื่องยูวี - วิซิเบิลสเปกโทรโฟโตมิเตอร์
เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์โดยทั่วไปจะประกอบด้วยส่วนต่าง ๆ ดังรูป ที่ 5
8.1 ต้นกำเนิดแสง (Light Source)
ต้นกำเนิดแสงที่ใช้ในงานทางสเปกโทรโฟโตรเมตรีนั้น ควรจะต้องมีลักษณะดังนี้
1. จะต้องให้ลำแสง (beam of radiation) ที่มีกำลังพอที่วัดได้ด้วยมาตรแสง (photometer)
2. จะต้องให้การแผ่รังสี (radiation) ออกมาตลอดเวลาในช่วงความยาวคลื่นที่ต้องการ
3. จะต้องให้การแผ่รังสีที่คงที่ตลอดเวลา นั่นคือ Po ต้องคงที่ มิฉะนั้นแล้วผลของการวิเคราะห์จะไม่เม่นหรือไม่มีความเที่ยง
สำหรับเครื่องยูวี – วิสิเบิลสเปกโทรโฟโตมิเตอร์นั้น ต้นกำเนิดแสงอัลตราไวโอเลตเป็นหลอด
ไฮโดรเจน (hydrogen lamp) หรือหลอดดิวเทอเรียม (deuterium lamp) ให้แสงอยู่ช่วงความยาวคลื่น
185 – 375 nm

8.2 โมโนโครเมเตอร์ (Monochromator)
ส่วนประกอบที่ถือว่าเป็นหัวใจของเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ เพราะเป็นส่วนที่ใช้ควบคุม
แสงโดยจะทำให้แสงที่ออกมาจากต้นกำเนิดแสง ซึ่งพอลิโครเมติก (คือแสงที่ประกอบด้วยแสงที่มีความยาวคลื่นต่าง ๆ) ให้เป็นแสงโมโนโครเมติก ซึ่งเป็นแถบแสงแคบ ๆ ความจริงโมโนโครเมเตอร์จะประกอบไปด้วย

1. ช่องที่ปล่อยให้แสงเข้า (entrance slit)
2. กระจกและเลนส์ (mirror และ lens)
3. ส่วนที่ใช้ทำให้แสงกระจายออกเป็นความยาวคลื่นต่าง ๆ กันเพื่อให้เหมาะแก่การเลือกใช้
หรืออาจเป็นส่วนที่ตัดแสงบางช่วงออกไปให้เหลือเฉพาะช่วงคลื่นแสงที่ต้องการอุปกรณ์ส่วนนี้อาจประกอบไปด้วย
3.1 ฟิลเตอร์
3.2 ปริซึม
3.3 เกรตติง
4. ช่องแสงออก
8.3 ส่วนที่วางสารตัวอย่างเพื่อวัด (cell Compartment)
เซลล์ที่บรรจุสารตัวอย่างและสารปรับเทียบแล้วนำไปใส่ที่สำหรับวัด ซึ่งส่วนนี้จะมีฝาปิดเพื่อกันแสงจากภายนอกจะเข้าไปและถูกกั้นออกจากส่วนที่เป็นระบบอิเล็กทรอนิกและระบบแสง
8.4 เครื่องวัดแสง (Radiation Detector)
เครื่องที่ใช้สำหรับวัดแสงนั้นมีด้วยกันหลายแบบ ซึ่งแต่ละแบบอาจแตกต่างกันบ้างที่ความกว้างของช่วงคลื่นแสงที่สามารถตรวจสอบได้ ความเร็วของการตอบสนองต่อแสง สภาพไวของการรับแสง เป็นต้นทั้งนี้เพื่อต้องการเปลี่ยนพลังงานแสงให้เป็นสัญญาณไฟฟ้า
8.5 เครื่องขยาย-แยกสัญญาณและประมวลผล
สัญญาณได้จากเครื่องวัดจะนำไปเข้ากระบวนการของระบบอิเล็กทรอนิก เช่น ขยายสัญญาณให้มากขึ้น หรืออาจเปลี่ยนสัญญาณ D.C. เป็น A.C. หรือ A.C. เป็น D.C. อาจมีการกรองสัญญาณที่ไม่ต้องการออกไป หรือนำสัญญาณที่ได้ไปแยกออก (และเข้ากระบวนการทางคณิตศาสตร์) เข้าเครื่องอินทิเกรชัน หรือเปลี่ยนให้เป็น log scale
จากนั้นสัญญาณที่ได้ซึ่งเป็นผลของการวิเคราะห์จึงได้เสนอออกมามีหลายรูปแบบ โดยต่อเข้ากับ
1. มิเตอร์
2. ดิจิตัลมิเตอร์
3. เครื่องบันทึก เรคอร์เดอร์ หรือพริ้นเตอร์
4. เครื่องไมโครคอมพิวเตอร์หรือไมโครโปรเซสเซอร์